免疫球蛋白G (IgG) 的纯化(二):
基本方案2 蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析
蛋白A 通常用于人(除lgG3外;小鼠lgG1 结合力也较弱)、兔、豚鼠和猪抗体的纯化。
材料
腹水或MAb 上清
PBS, pH8.0 和pH 7.3
1mol/L NaOH
蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
0.1mol/L 柠檬酸, pH 按照所分离的抗体亚类的需要而定(步骤3)
10% (m/V) NaN3 (可选)
硼酸盐缓冲液(可选)
3mol / L 过滤后的硫氰酸钾
玻璃棉 (Polysciences)
离心机,转子,4 ℃
0. 45μm 滤器,过滤MAb 上清
透析袋
1. 5cmX 10cm 层析柱(如铺有玻璃棉的10ml 注射器)
组分收集器
蠕动泵(可选)
流程
1a. 适用于腹水: 用玻璃棉去除腹水中脂类,用10 倍体积的PBS, pH 8.0 稀释腹水。
1b. 适用于MAb 上清: 于4℃ 将MAb 上清以 20000g 离心后用 0.45μm 滤器过滤。对于 lgG1 抗体,用透析(对pH8. 0 PBS) 或者加入1mol/L NaOH 的方法调整其pH到8.0 。对于其他抗体亚类则调整到pH7. 4.
2. 将蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 装入1. 5cmX 10cm 层析柱中, 连上组分收集器。于4℃ 或室温下用PBS , pH8. 0 平衡层析柱。上样(1ml 至几升)当上样量大时,可用蠕动泵或重力帮助上样。每亳升胶可结合约5mg 小鼠IgG 或 8mg 人IgG。用流式细胞仪或ELISA 检测流出的未结合组分中的抗体活性,以判断上样量是否过量。
3. 用数倍柱体积的PBS, pH8.0 洗柱,一直洗到 A280 到基线水平。用适当pH 的0.1mol/L 拧檬酸缓冲液(用1mol/L NaOH 调整)洗脱目的蛋白:小鼠 lgG1 用pH6. 5 、lgG2 用pH4. 5 、lgG2 和 lgG3 用pH3. 0 。
低 pH 会损伤抗体,因此洗脱前在收集管内按每毫升洗脱液加入50μl 2mol/L Tris-HCl缓冲液,用于立刻中和酸。
4. 合并含目的蛋白的组分,将合并组分倒入透析袋,用含或不含有0.02 % NaN3的1L PBS (pH7.3) 透析,期间更换二次透析液,然后置于 4°C 保存。必要时可用SDS-PAGE 进行纯度鉴定。
5. 层析柱可以先用1 倍柱体积的过滤后的3mol/L 硫氰酸钾清洗,然后再用数个柱体积的PBS pH7. 3 洗柱, 最后保存于4°C 。