提高云杉和山毛榉木葡糖醛酸木聚糖的活性：
HPAEC–PAD 色谱图显示了PASC和WAX38或WAX22与TtLPMO9E 和/或UmGH62在pH 6.5和40 °C下孵育16小时后产生的可溶性产物。图c显示了将UmGH62的剂量从15 µM降低到1.5 µM的效果。由PASC降解产生的氧化纤维寡糖标记为“GlcXox”，其中X表示聚合度。显示由LPMO催化的WAX22或WAX38在Um存在下降解产生的新产品的区域GH62 用灰色箭头和括号表示。对照反应表明，产物形成取决于LPMO和还原剂不含LPMO的对照反应包含0.5 mM CuSO4，以解释可能的副反应
用UmGH62阿拉伯呋喃糖苷酶和BoGH115A α-葡糖醛酸糖苷酶脱支可提高LPMO对云杉和山毛榉木葡糖醛酸木聚糖的活性
由于脱支对WAX 上TtLPMO9E活性的影响很明显，我们分析了这种影响是否也适用于其他类型的木聚糖以及其他LPMO9。首先我们测试了之前报道的TtLPMO9G 对云杉阿拉伯葡糖醛酸木聚糖的弱活性是否可以通过使用UmGH62和/或BoGH115A对这种木聚糖进行脱支来增强。
使用的SpAGX底物含有70.6%的木糖、10.7%的阿拉伯糖和12.4%的MeGlcA。博GH115A 预计会去除GlcA和MeGlcA基团，优先选择与内部木糖残基相连的基团，使其成为脱支 SpAGX 的良好候选者。
添加BoGH115A对SpAGX上几乎检测不到的TtLPMO9G活性影响很小。9-14分钟洗脱区域中几乎看不见的小峰表明，由于添加BoGH115A，活性可能略有增加。添加UmGH62确实导致LPMO产品的产生增加，洗脱时间比从WAX产生的最突出的LPMO产品晚。这种延迟洗脱可能是由于葡萄糖醛酸部分的存在给产品增加了电荷，导致延迟洗脱。
最有趣的是，添加两种脱支酶导致TtLPMOG的产物生成明显增加，证明了BoGH115A 和UmGH62的脱支活性之间的协同作用，并且需要去除阿拉伯糖和MeGlcA以增加对SpAGX的敏感性LPMO。值得注意的是，在还含有BoGH115A的反应中不再检测到仅在与UmGH62的反应中可见的潜在葡糖醛酸化LPMO产物。
没有还原剂或没有LPMO的控制反应证实可见的产物确实是LPMO作用的结果。含有BoGH115A的对照反应显示一个主峰在7分钟洗脱，这可能是释放的MeGlcA。
HPAEC-PAD色谱图显示在存在或不存在脱支酶的情况下，将TtLPMO9E或TtLPMO9G与PASC和SpAGX或 BeGX的混合物孵育时产生的可溶性产物。由PASC降解产生的氧化纤维寡糖标记为“GlcXox”，其中X表示聚合度。
灰色箭头和括号表示在存在脱支酶的情况下由LPMO催化的SpAGX或BeGX降解产生的新产品的区域。所有反应均在pH 6.5和40°C下进行16小时。不含还原剂或LPMO的对照反应的色谱图未显示氧化产物
在我们之前的研究中，我们从T. terrestris中鉴定了具有木聚糖活性的LPMO9，TtLPMO9E 对几种木聚糖显示出最高的活性，但它对SpAGX没有显示出任何活性。有趣的是，当将BoGH115A 和UmGH62添加到与PASC、SpAGX和TtLPMO9E的反应中时，SpAGX很容易降解，产生的木聚糖衍生产物水平高于使用TtLPMO9G获得的产物。
在包含UmGH62和BoGH115A的反应中获得的产物分布在TtLPMO9G和Tt之间不同LPMO9E，表明这两种LPMO9在耐受木聚糖主链取代方面存在差异。值得注意的是，与TtLPMO9E、UmGH62和BoGH115A反应的色谱图中缺乏主要的纤维素衍生峰；这可能表明脱支的SpAGX与PASC一样是TtLPMO9E的底物，甚至更好。
用于生物质加工的木质纤维素分解酶混合物的开发：
来自粗糙脉孢菌、嗜热毁丝霉、鹅足孢菌、肉桂畸枝菌和The rmothielavioidesterrestris的LPMO9的研究揭示了这些酶对半纤维素的活性，例如来自罗望子种子的木葡聚糖、来自魔芋的葡甘露聚糖、来自山毛榉和桦木的葡糖醛酸木聚糖，以及燕麦阿拉伯木聚糖。在木聚糖的情况下，LPMO9活性，即氧化产物的还原剂依赖性生成，只有在使用也含有纤维素的反应混合物时才得到令人信服的证明。
这种对纤维素存在的依赖性已通过木聚糖的预期构象变化来解释，木聚糖在溶液中采用三重螺旋构象，但与纤维素结合采用更加拉伸的双螺旋结构，允许对纤维素有很强的吸附作用。由此产生的木聚糖-纤维素共聚结构的平坦表面似乎很好地适应了木聚糖活性LPMO9的平坦底物结合表面，并且可能模仿了天然植物细胞壁中这些多糖的超微结构。
T. terrestris是一种嗜极端子囊菌丝状真菌，它编码并利用过多的木质纤维素活性酶，包括许多AA9 LPMO。在之前的一项研究中，我们已经表征了来自土生土霉LPH172的六种LPMO9，其中三种表现出对山毛榉木、桦木和/或云杉木聚糖的活性，只有当这些木聚糖与磷酸溶胀纤维素结合时。
有趣的是，我们的研究揭示了木聚糖活性LPMO之间主要的替代依赖差异。例如，TtLPMO9E 对乙酰化和非乙酰化葡糖醛酸木聚糖都显示出活性，但对阿拉伯葡糖醛酸木聚糖没有活性，而TtLPMO9G 对非乙酰化葡糖醛酸木聚糖和阿拉伯葡糖醛酸木聚糖显示出活性。这些具有木聚糖活性的LPMO均未显示出对小麦阿拉伯木聚糖的活性，这与Frommhagen等人的早期观察结果一致。谁得出结论，木聚糖活性MtLPMO9A不作用于这种高度取代的木聚糖类型。
综上所述，上述考虑和观察使我们得出这样的假设，即LPMO9s在木聚糖上的活性可能受到脱支酶的调节，例如葡萄糖醛酸酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，因为脱支都会调节LPMO易感性的关键形成木聚糖-纤维素复合物并影响LPMO与木聚糖相互作用的能力。
因此我们着手研究 LPMO9 对多种木聚糖WAX、云杉阿拉伯葡糖醛酸木聚糖、山毛榉木葡糖醛酸木聚糖的活性是否受GH62 α阿拉伯呋喃糖苷酶和/或 GH115葡萄糖醛酸酶。结果表明，一般来说，脱脂会导致LPMO9的木聚糖分解活性增加，并且在某些情况下使LPMO9在以前未检测到活性的底物上具有活性。
我们还表明，LPMO9s的木聚糖分解活性取决于反应混合物中存在的纤维素类型。除了支持脱脂酶对纤维素-木聚糖相互作用的影响之外，我们的结果支持这样一种观点，即AA9 LPMO可能在葡聚糖降解中发挥重要作用，这可能取决于与脱脂酶的相互作用。这种相互作用，以及新发现的LPMO9s在木聚糖上的活性，可能与未来用于生物质加工的木质纤维素分解酶混合物的开发有关。
我们的结果支持AA9 LPMO可能在木聚糖降解中发挥重要作用的观点，这可能取决于与脱脂酶的相互作用。这种相互作用，以及新发现的 LPMO9s 在木聚糖上的活性，可能与未来用于生物质加工的木质纤维素分解酶混合物的开发有关。我们的结果支持 AA9 LPMO 可能在木聚糖降解中发挥重要作用的观点，这可能取决于与脱脂酶的相互作用。
这种相互作用，以及新发现的 LPMO9s 在木聚糖上的活性，可能与未来用于生物质加工的木质纤维素分解酶混合物的开发有关。
纤维素的类型影响木聚糖分解LPMO9活性：
为了进一步了解产物形成，通过MALDI-TOF MS分析了在UmGH62和Bo GH115A存在下，TtLPMO9G在与PASC和SpAGX 的反应中产生的可溶性化合物。支持HPAEC-PAD分析的结果，MS光谱显示由纤维素和木聚糖裂解产生的氧化反应产物。最长的可检测氧化纤维低聚物包含八个葡萄糖单元，由于较长的纤维素片段的溶解度有限，通常会观察到这一点。源自木聚糖降解的产物更长，范围可达至少十五个戊糖单体。
由于吡喃木糖和阿拉伯呋喃糖单元的脱水质量均为132 Da，因此无法区分产物是线性的还是还包括阿拉伯糖取代。主要的木聚糖衍生产物是天然低聚物的单钠加合物、氧化低聚物和后者的水合形式，以及水合形式的钠盐。这些产品形式通常在与C1氧化LPMO的反应中观察到。MS分析证实无还原剂的控制反应没有产生氧化产物。
在不含UmGH62和BoGH115A的对照反应中，仅鉴定出纤维素衍生产物。值得注意的是，质谱图显示了几种木聚糖衍生产品，其质量对应于MeGlcA 取代的木寡糖。尽管MALDI–TOF MS应该被认为是严格定性的，但有趣的是，这些产品峰的强度比那些属于非MeGlcA取代产品的峰强度弱得多，考虑到BoGH115A在反应。
在UmGH62和Bo GH115A存在的情况下，TtLPMO9G在与PASC和SpAGX的反应中释放的产物的MALDI-TOF MS分析。a和b分别显示从700到1400和从1400到2100的m/z区域。顶部光谱显示存在还原剂时的反应，中间光谱显示不含还原剂的对照，底部光谱是不含UmGH62 和Bo的对照反应GH115A。
天然和氧化纤维素衍生产品标记为蓝色，天然和氧化木聚糖衍生产品标记为绿色或红色。浅色和深色分别代表天然和氧化形式。“Pen”代表戊糖并表示木聚糖衍生产物，其中后者可以是线性的或被阿拉伯呋喃糖取代。所有标签均指单个Na-加合物。氧化产物的水合形式标有 *，而醛糖酸或羧酸的钠盐标有
此前，TtLPMO9E和较小程度上的TtLPMO9G已被证明对未被阿拉伯糖基化的山毛榉木葡糖醛酸木聚糖具有活性。将BoGH115A添加到与PASC和BeGX的反应中增加了两种TtLPMO9的活性。有趣的是，同样如上所述，在与TtLPMO9E 和BoGH115A反应的产物概况中，纤维素峰不再占主导地位，再次说明了该LPMO的高木聚糖分解活性。不含LPMO或还原剂的对照反应的色谱图证实了LPMO催化了产物的形成，并证明了BoGH115A催化的GlcA释放。
半纤维素吸附到纤维素上还取决于纤维素材料的来源和相关特性。例如Kabel 等人 年证明，与 Avicel 相比，木葡聚糖对细菌纤维素的吸附更好，并假设这是由于细菌纤维素的表面积较高。已经表明在 PASC 中，溶剂可及的原纤维表面比在Avicel中更突出。
为了解不同纤维素底物的影响，我们测试了Avicel和PASC作为纤维素基质与TtLPMO9E和WAX30的反应，在不存在或存在Um的情况下GH62。与PASC的反应在UmGH62处理的WAX30上显示出明显的木聚糖分解活性，正如基于上文讨论的与WAX22和WAX38的类似反应的结果所预期的那样。
出乎意料的是，在与Avicel的反应中，LPMO催化的WAX30降解几乎完全不存在。将PASC添加到与Avicel、WAX30和Um GH62的TtLPMO9E反应中恢复了木聚糖上的LPMO活性，表明WAX30并非不可逆地吸附到Avicel上，并且与Avicel相比，WAX30更容易吸附到PASC上。值得注意的是，向Avicel添加WAX30如何阻碍Avicel上的LPMO9活性；这增加了WAX30确实结合并覆盖Avicel纤维的概念。没有还原剂的对照反应没有形成任何产物。
酶促脱脂是AA9裂解多糖单加氧酶木聚糖降解活性的关键决定因素：
使用磷酸溶胀纤维素和小麦阿拉伯木聚糖的混合物，我们表明用GH62阿拉伯呋喃糖苷酶去除阿拉伯糖取代导致木聚糖更好地吸附到纤维素上，并使LPMO催化裂解这种木聚糖。此外，用来自云杉的PASC和阿拉伯葡糖醛酸木聚糖的混合物进行的实验表明，用GH62阿拉伯呋喃糖苷酶和GH115葡糖醛酸糖苷酶对木聚糖进行脱脂可以促进 LPMO 活性。
对含有PASC和山毛榉木葡糖醛酸木聚糖的混合物的分析表明，GH115作用也促进了该木聚糖上的LPMO活性。值得注意的是，当WAX在GH62存在的情况下与Avicel而不是PASC一起孵育时，LPMO9对木聚糖和纤维素的降解均受到损害，表明纤维素-木聚糖复合物的形成及其对LPMO作用的敏感性也取决于纤维素的性质。
这些脱脂效应不仅与纤维素-木聚糖相互作用的调节有关，这会影响木聚糖的构象和刚性，而且还可能影响LPMO木聚糖相互作用，因为脱脂会改变木聚糖表面的结构。
多糖降解裂解性多糖单加氧酶是金属酶，其活性取决于催化中心和氧共底物中单个铜原子的还原。属于辅助活动家族 9, LPMO9s, 在 C1 处氧化其纤维素或半纤维素底物，导致形成与糖醛酸平衡的内酯，或在C4处氧化，导致形成与宝石二醇平衡的4-酮醛糖。
一些LPMO9产生 C1 和 C4 氧化产物的混合物，因此可能产生双氧化产物，而在某些情况下，还观察到C6处的氧化。LPMO于被发现并且由于它们能够显著提高纤维素酶混合物中纤维素酶的活性，纤维素酶混合物被用于将可再生生物质中的碳水化合物转化为可发酵糖，用于生产燃料和化学品，因此引起了工业生物技术领域的广泛兴趣。LPMO9在纤维素糖化中的作用已被详细研究。
越来越清楚的是，某些LPMO9s除了作用于线性和结晶纤维素外，还可以作用于一种或多种半纤维素，例如木葡聚糖、葡甘露聚糖和阿拉伯木聚糖，无论是单独作用还是吸附在纤维素上时。值得注意的是，这些半纤维素是杂聚物，通常在主链上带有取代基，这引发了有关LPMO9的底物特异性及其与参与半纤维素脱支和解聚的其他酶的相互作用的有趣问题。
次生植物细胞壁是植物生物质的主要成分，主要由纤维素、各种半纤维素和木质素组成。它们的化学性质和超分子结构使植物细胞壁成为坚固的生物复合材料，可以抵抗化学、生物和物理压力。
纤维素的顽固性来自其晶体结构，该结构由许多氢键、疏水相互作用和范德华力稳定。半纤维素与纤维素共享β-(1,4)连接的单糖主链，但缺乏晶格，并且是具有许多不同单糖结构单元的杂聚物。此外，半纤维素在植物甚至组织之间的分子组成和结构上表现出很大的差异。被称为木聚糖的半纤维素由β-1,4连接的木吡喃糖单体主链组成，这些单体通常被阿拉伯糖和/或葡萄糖醛酸等装饰糖取代，并且可能带有乙酰基。根据它们的主要取代，木聚糖通常被称为葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖或阿拉伯葡糖醛酸木聚糖。
尽管需要进一步证实，但已知木聚糖通过吸附到纤维素而在植物细胞壁中具有束缚功能，并且吸附强度取决于取代的程度和模式。据报道，来自被子植物和裸子植物的木聚糖会出现糖基取代和乙酰化的规则基序，这些基序被认为在调节半纤维素的相互作用中起重要作用含纤维素和木质素。
目前的数据表明，对于具有低取代度或规则取代模式的木聚糖，吸附最强。没有或只有很少取代的木聚糖倾向于相互聚集和/或与纤维素强烈结合。已经表明，木聚糖对纤维素的吸附也取决于后者的关键特性，例如纤维素晶体几何形状、表面积、孔隙率和结晶度。
