肠道腺病毒是世界上导致病毒性胃肠炎的主要原因之一，它必须能够承受肠道中的恶劣条件。这一要求表明衣壳的稳定性必须不同于其他腺病毒。我们报道了人肠道腺病毒HAdV-F41的4-分辨率结构，并将其与其他呼吸道(HAdV-C5)和眼部(HAdV-D26)嗜性腺病毒进行了比较。虽然六邻体、五邻体碱基和内部次要外壳蛋白IIIa和VIII的整体结构是保守的，但我们观察到部分有序的元素增强了顶点区域，这表明它们在增强HAdV-F41的物理化学衣壳稳定性中的作用。出乎意料的是，我们发现了一种不同于所有以前描述的人类和非人类乳腺炎病毒的外部次要外壳蛋白ⅸ的组织。对肠道腺病毒结构的了解为设计适合口服或肠道靶向的载体提供了一个起点。
腺病毒(AdVs)是可以被改造成治疗工具的病原体(一,2).到目前为止，已经描述了100多种人类adv(HadV)http://hadvwg.gmu.edu/；/)并归入7个种(HAdV-A至HAdV-G)。高致病性病会导致呼吸道和胃肠道的急性感染以及结膜炎。大多数AdV感染是亚临床的，但它们会导致免疫功能低下患者的显著发病率甚至死亡率(3).目前没有用于普通人群的疫苗(尽管有些疫苗可供美国军事人员使用)，也没有批准的AdV感染抗病毒疗法。
高分辨率(3.2至3.5)结构仅适用于两种高分辨率飞行器:HAdV-C5和HAdV-D26(四–6).AdV衣壳在未转化的病毒中脱颖而出，因为它的体积大(~950，150 MDa)，三角测量数(伪T= 25)，且成分复杂。刻面由240个三聚六聚体形成，而五聚体的五聚体碱基蛋白质填充顶点。依赖于病毒类型，不同长度的受体结合三聚体纤维从五聚体碱基(七).小外壳蛋白IIIa和VIII在内壳表面，而IX在外壳表面，有助于调节准等价的二十面体相互作用。膜溶解蛋白ⅵ与基因组浓缩蛋白ⅶ竞争结合到六邻体的内腔(5,8).
物种F中的高密度脂蛋白不寻常，因为它们具有狭窄的肠道嗜性。HAdV-F40和HAdV-F41是幼儿病毒性胃肠炎的三大病因之一，与轮状病毒和诺如病毒(9,10).它们占免疫活性症状儿童粪便中鉴定的adv的一半以上(11–13).相对于HAdV-C，HAdV-F的衣壳结构的差异可能会在体内肠化过程中赋予胃的稳定性。在酸性条件下孵育后的传染性测定表明，与HAdV-C5相比，HAdV-F41在低酸碱度下是稳定的，甚至可能是活化的(14).HAdV病毒编码两种不同纤维的事实与它们的肠道嗜性有关，尽管确切的关系尚不清楚(15,16).长纤维与柯萨奇病毒和AdV受体(CAR)蛋白结合，就像许多其他非肠道AdV物种的单纤维一样(17)，但尚未发现短纤维的受体。然而，用HAdV-F40的短纤维假分型HAdV-C5导致在酸性条件下对失活的抗性和口服或直肠给药后在肠中产生感染的能力(18).
在这里，我们使用冷冻电子显微镜来获得HAdV-F41病毒体的结构，并将其与其他两种已知的HAdV结构进行比较。我们在肠道AdV衣壳高度理化稳定性的背景下解释结构差异。
结果
HAdV-F41病毒粒子的理化稳定性
为了评估HAdV-F41病毒粒子的稳定性，我们评估了它们在用人工合成的胃、肠或胃以及肠液处理后的传染性。用流式细胞仪测定的绿色荧光蛋白荧光测定人胚肾(HEK) 293培养物中感染细胞的数量。无论是胃部还是肠道状况都不会降低传染性。在合成胃和肠液中连续孵育导致绿色荧光蛋白表达明显增加，表明传染性增强(图S1A)。也就是说，HAdV-F41不仅能抵抗酸性酸碱度，如前所示(14)，但它也是由酸化、盐和蛋白酶的联合作用激活的，这些蛋白酶在顺序的胃和肠治疗中发现。
我们还检测了HAdV-F41粒子与HAdV-C5粒子相比的物理稳定性，使用DNA嵌入剂YOYO-1的外源荧光来表征作为温度函数的衣壳破坏。随着基因组暴露于溶剂，两个样品的YOYO-1的荧光发射随着温度而增加(图S1B)。而半转变温度(T0.5)HAdV-C5估计为47℃(8)，对于HAdV-F41，DNA暴露的最大速率发生在51℃附近。该结果表明HAdV-F41粒子比HAdV-C5更热稳定。
HAdV F41整体结构
分辨率为4.0的HAdV-F41低温电磁图(图1图S2和表S1)显示了所有以前的AdV结构共有的一般特征:直径约为950的伪T= 25个二十面体粒子，每个面有12个三聚六角体顶点，加上顶点的五聚五角体顶点。蛋白九的氮末端位于外壳表面，在六邻体三聚体形成的谷中(图1B，顶部)。在二十面体壳的内表面上可以观察到小的外壳蛋白IIIa和VIII，加上VI和核心蛋白VII的小片段，朝向病毒体核心(图1B，底部)。由于它们的柔韧性和与五子基底的对称性不匹配，当施加二十面体对称性时，纤维不能通过冷冻电磁来分辨。
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图1HAdV-F41在4.0℃时的低温电磁结构。
（A)HAdV-F41地图的放射状彩色表面渲染，沿二十面体双轴观察。一面由白色三角形标识。二十面体对称轴用白色符号表示:五重(五边形)、三重(三角形)和双重(椭圆形)。高斯滤波器已应用于地图，以强调主要特征。（B)在二十面体HAdV-F41面追踪的主要和次要外壳蛋白的分子模型。顶部:从衣壳外面看。底部:衣壳内部视图。蛋白质颜色如左侧图例所示。不对称单位中的四个六邻体三聚体编号为H1到H4。（C)漫画描绘了二十面体AU和周围的六边形，从衣壳外面看。二十面体对称轴用红色填充符号表示。空心红色三角形表示六边形2、3和4之间的L3轴。
除了蛋白质ⅵ和ⅷ，HAdV-F41结构多肽比它们的HAdV-C5对应物短(表S2)。序列同一性在52%和78%之间变化。六邻体和五邻体碱基的预测等电点表明HAdV-F41的更基本的衣壳表面(14)，除了外部胶结蛋白ⅸ的贡献，它明显更酸性(表S2)。在衣壳内表面，蛋白质IIIa、VI和VIII在肠道AdV中酸性更强。
主要外壳蛋白:六邻体
HAdV-F41六边形的结构与HAdV-C5非常相似(图2A和表S2()5).形成三聚体假六边形碱基的每个单体中的双果冻卷是高度保守的。不出所料(19)，结构之间的主要区别在于位于六邻体塔中的环，即所谓的高变区(HVRs)，其构成暴露在病毒体表面的血清型特异性表位(图2，A和B，和表S3)。和HAdV C5一样，HAdV F41的HVR是灵活的(补充文本和图S3A)，但是我们能够完全跟踪除HVR4以外的所有hvr(图2，A和B，和表S4)。HVR1中的32残基酸性环，为物种C中的HAdVs所独有(20)，在任何可用的HAdV-碳六邻体结构中都没有发现。我们能够在HAdV F41中完全追踪HVR1，可能是因为它的较短长度限制了灵活性(图2B和桌子S3)。残基Tyr784HAdV-C5和HAdV-F41之间的均方根偏差(RMSD)为%3E2，可能与蛋白九的不同相互作用有关(参见下文“蛋白九的无序密度”部分)。除了人类表皮受体，已经描述的HAdV-C5和HAdV-D26的其他区域也显示出HAdV-F41中二十面体不对称单元(AU)中12个六邻体单体的可变性(补充文本和图S3A)。
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图2Hexon和penton基础结构。
（A)HAdV-C5[蛋白质数据库(PDB) ID: 6B1T链A，青色]和HAdV-F41六邻体单体的叠加，用均方根偏差着色(RMSD)。超过嵌合体RMSD截止值的残基，或者RMSD计算不可能的残基，因为它们在HAdV C5中没有被追踪，是紫色的。指示相对于衣壳的方向(外侧/内侧)。不适用。（B)来自HAdV-C5和HAdV-F41的六邻体人类乳头瘤病毒的序列比对。在这里和(D)中，灰色条表示跟踪区域。HAdV-C5酸性区域用黑色矩形突出显示。氨基酸是按极性着色的。（C)如(A)中由RMSD着色的HAdV-C5戊基单体(PDB ID: 6B1T链M，粉红色)和HAdV-F41的叠加。可变环和纤维结合重排区域用灰色网格图显示。（D)序列比对集中在五子碱基(PB) N末端臂、可变和高变环以及疏水边缘；以及HAdV-C5 (PDB识别号:3IZO)和HAdV-F41纤维的L(长)和S(短)末端肽。黑色矩形突出了RGD/IGDD序列基序、保守的纤维肽和非保守的Ser426在疏水边缘。直方图表示该列中所有对的平均成对同一性。（E)五聚体的五聚体碱基显示为一种单体为黑色，其余为白色。在纤维结合环中与HAdV-C5保守的疏水残基被染成青色(Phe412，Tyr413，Tyr419，和Leu422)，以及那些未送达的(Ser426)都是褐红色的。（F)由表面静电势着色的HAdV-C5和HAdV-F41五聚体。
顶点顶点:彭顿基
HAdV-F41 penton碱基蛋白的结构与HAdV-C5非常相似(图2C和表S2()5).如在先前解决的结构中(四,6)，前34个氨基酸无法追溯(图2D和桌子S4)。这个区域要么是灵活的，要么被隐藏在嘈杂的、非共轴的地核密度中。然而，弱密度表明其位于HAdV-F41(见下文“蛋白质六和七及其他内部元素”一节)。这种蛋白质比HAdV C5短63个氨基酸(表S2)。这种长度差异主要对应于五聚体外围的高变环，其在HAdVC-5中带有整合素结合RGD (Arg-Gly-Asp)序列基序(图2，C和D).除了HAdV-F40和HAdV-F41以外，所有的HAdV都带有这种RGD图案，而-F41有RGAD(精氨酸-甘氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)和IGDD(Ile-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)21)，以及HAdV-D60，它删除了循环(22).RGD环非常灵活，排除了在任何可用结构中的跟踪。在HAdV-F41中，含IGDD的区域比HAdV-C5 RGD环短57个残基，但也无法追踪(图2，C和D，和表S4)，表明尽管它短得多，但也很灵活。可变循环(Glu148到Leu156)，五聚体碱基序列中最不保守的区域之一，同样暴露在五聚体的外围，在HAdV-F41中也具有不同的构象(图2，C和D).这个环的作用是未知的，但是它已经被提议作为基因治疗的工程位点(23).
AdV纤维的N端肽(图2D)结合到形成于五聚体中五聚体单体之间的界面处的凹槽上。参与这种相互作用的五子碱基和纤维残基都是保守的(23)，并且我们没有观察到该区域的结构差异。然而，我们注意到纤维轴的起点和五聚体中心的疏水残基环之间的相互作用可能存在差异(23,24).在这个区域，纤维序列不保守(图2D).在HAdV-F41的五子基中，形成环的疏水残基是保守的，除了HAdV-C5苯489，它是极性残基(Ser426)在HAdV-F41(图2，D和E).在爵士旁边426Thr427到Thr430有一个大RMSD来自HAdV的等价残基——C5(图2C).这个区域形成了更大范围的一部分(Tyr419到Leu442)在纤维结合时发生构象重排(23).这些观察结果表明，在HAdV-F41中，纤维-喷顿体结合模式不同，与HAdV-C5相比，疏水性更低，氢桥相互作用更多。我们还发现了HAdV-C5和HAdV-F41之间的一些差异，这些差异存在于戊酮碱基单体之间的相互作用，以及戊酮碱基和周围的内烯基六邻体之间的相互作用，这些在补充文本和图S3 (B和C)中有所描述。最后，在朝向病毒核心的五聚体空腔，Arg47HAdV-C5中的残基形成一个带正电荷的环，而HAdV-F41中没有，它含有甘氨酸45相反(图2F).这种电荷变化表明了五聚体碱基和病毒基因组或其包装机械之间的不同相互作用。
外部固井网络:蛋白质九
蛋白IX是唯一位于腺病毒外壳表面的结合蛋白。以前的研究(四,6)的研究表明，AdV衣壳的一个面中的蛋白IX的12个单体中的每一个都呈现出一种延伸的构象，并且由三个结构域组成。三个ⅸ分子的氮端结构域以三颗粒状特征结合在一起。每个面中的四个三粒子中的一个占据二十面体三重对称轴(I3)处的六粒子之间的谷，而其他三个位于由六粒子2、3和4在AU(图1B和3A).蛋白九的中心结构域高度灵活，也被称为“绳结构域”在HAdV-C5和HAdV-D26中，三个构象独特的IX分子的绳状结构域，每个起源于不同的三粒体，在二十面体面的表面上围绕六粒体爬行，直到它们到达边缘。在那里，这三个分子的碳末端结构域与来自相邻小平面的第四个结构域结合，形成具有三个平行和一个反平行α螺旋的螺旋线圈。每个面有三个这样的四螺旋束(图3A).在非人乳腺病毒中，绳状结构域较短(图3B)，IX的C端结构域形成螺旋线圈，只有三个平行的α-螺旋直接位于其N端三颗粒的顶部(每个面有四个这样的束)，如牛AdV BAdV-3结构所示(图3A) (25–28).在所有HAdV-F41结构蛋白中，蛋白IX与其HAdV-C5对应蛋白最不相似(表S2)。
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图3蛋白IX三颗粒结构。
（A)显示HAdV-C5、BAdV-3和HAdV-F41中蛋白质IX的组织的示意图，其中仅N末端结构域是有序的。位于I3对称轴(实心三角形)的三粒子呈青色，位于L3轴(空心三角形)的三粒子呈几度粉红色。虚线:HAdV-C5一九单体中的绳状结构域在每个示意图的顶部以青色描绘。（B)HAdV-C5、HAdV-D26、HAdV-F41和BAdV-3中蛋白质IX的基于结构的序列比对。黑色文本:不同结构中的残基模型。黑色背景上的白色文本:未建模的区域。灰色背景:模型化的区域，但不是在IX的所有独立副本中。红色方框:HAdV-F41中的N末端额外残基、三颗粒疏水核心和多聚-Ala延伸(BAdV-3中没有)。蓝色方框突出文本中讨论的两个Phe残基。蓝色箭头:两个灵活的弯曲。（C)HAdV-F41蛋白IX的N末端结构域从蓝色(N末端)到红色(最后追踪的残基)呈彩虹色，密度图为灰色网格，并放大到本文中讨论的疏水残基。（D)HAdV-C5 (PDB识别号:6B1T)、HAdV-F41和HAdV-D26 (PDB识别号:5TX1)中三颗粒的比较。最上面一排:从衣壳外面看到的三粒。底部:旋转90度的视图，这样六边形壳表面将位于底部。
我们追踪了瓦尔的残留物10致Gly59（图3C)，其以非常类似于HAdV-C5的方式形成三颗粒。如前所述(四)，三粒体由疏水性残基的核心——Tyr支撑20到Leu21在HAdV-F41(图3，B和D).第一个残基在三粒子中心折叠。值得注意的是，这种安排意味着12菲比17向三颗粒核添加两层疏水相互作用(图3D).在HAdV C5中，两种苯丙氨酸中的一种不存在(瓦尔11；图3B)，以及包含另一个的区域(Phe6)无法追踪，意味着缺少二十面体顺序(图3D).两个苯丙氨酸残基(Phe8菲比13；图3B)在HAdV-D26蛋白IX中被模拟，但是在不同的构象中，从三颗粒核心向外取向(图3D).
与HAdV-C5相比，HAdV-F41中的蛋白质九在氮末端有五个残基插入(与HAdV-D26相比有四个残基插入)。BAdV-3中的N端结构域甚至更短(图3B).我们假设，在HAdV-F41中，包含两个苯丙氨酸残基的区域比在HAdV-C5中更有序，并且与HAdV-D26的构象不同，因为存在这些额外的残基。I3轴三颗粒的低密度可以解释较长的氮末端的存在(图4，A和B).三颗粒核心疏水残基的密集网络和九颗粒氮端额外残基的存在都会增强三颗粒内的分子间相互作用，可能有助于稳定蛋白九三聚体。先前已经表明，三颗粒足以在HAdV-C5中提供衣壳热稳定性(29).更稳定的三颗粒可能增强HAdV-F41的理化稳定性。
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图4蛋白质IX的组织。
（A)外部残余密度(绿色和黄色，不清晰，0.2σ)。建模的三粒子是青色(I3轴，I3 NT)和品红色(L3轴，L3 NT)。虚线矩形:螺旋束在HAdV-C5中的位置。（B)残图解读。除了(A)中所示的元素之外，L3轴上突出的密度是蓝色的，绳索区域的建议路径对应于虚线中的每个三粒子。（C)漫画代表了这样一种假设，即碳末端结构域结合形成一个移动的、尖峰状的结构，其密度被平均化。Hexon HVR2循环会限制IX的灵活性，产生最明显的模糊密度(深蓝色斑点)。不太强烈的深蓝色代表在一些局部重建类别中观察到的较弱密度(图S5B)。（D)在HAdV-C5/D26和HAdV-F41中，形成I3三颗粒的IX分子的绳状结构域遵循不同的路径。形成HAdV-D26 I3三颗粒的IX单体之一是绿色的；青色HAdV-F41中的等效单体；和品红色的HAdV-F41 L3三粒子。灰面:HAdV-F41残图。半透明表面上的六邻体(H3、H3、H4)。顶部:从衣壳外部看，如(A)所示。底部:按指示旋转后的侧视图。请注意，L3处的模糊密度突出于六重塔之上。（E)放大三粒子结束和绳域转弯的区域。绿色，HAdV C5和HAdV D26中IX的重叠结构。HAdV-D26残基标签用下划线标出。虚线:HAdV-C5和HAdV-F41的未被追踪的绳域。灰色网格:对应绳域的HAdV-F41剩余密度。RMSD值大于2的六邻体氨基酸是红色的。
蛋白质九的无序密度
出乎意料的是，在HAdV-F41图中，在二十面体边缘没有对应于碳末端四螺旋束的密度。相反，我们观察到在L3轴上三粒子顶部的六粒子塔2、3和4之间径向突出的模糊密度(图4B和图S4)。这种突起的存在表明，在HAdV-F41中，蛋白IX的碳末端结构域可以以类似于BAdV-3中较短的蛋白IX的方式排列，形成直接邻近每个三颗粒的三螺旋束(图3A).然而，在我们的HAdV-F41图中，在三重二十面体轴的三粒子附近没有等效的弱密度(图4B和图S4)，表明IX的组织不同于BAdV-3。没有对称实施的局部重建和分类没有产生在I3轴具有突起或密度的任何粒子子集，该子集可以指示在衣壳边缘存在四螺旋束(图S5)。因此，HAdV-F41蛋白九的碳末端结构域的排列似乎不符合先前观察到的典型人类或非人类AdV结构。
残余图(显示衣壳表面上未被追踪的分子占据的弱密度)表明L3轴上的三颗粒和每个小平面中心的三颗粒之间的连接(图4，A和B).我们解释说，这种联系对应于中心三颗粒中一种单体的绳状结构域，如在HAdV-C5中那样，在衣壳表面向小平面边缘延伸。如果是这种情况，有可能在HAdV-F41中，蛋白IX的四个拷贝的C末端结构域(三个来自L3三颗粒，一个来自I3)不是在衣壳边缘相互作用，而是在L3轴(图4B).那么，为什么在我们的地图上没有螺旋簇呢？二级结构预测表明，HAdV-F41中的碳末端螺旋比HAdV-C5、HAdV-D26和BAdV-3中的对应螺旋短(图S6)，因此一种可能性是螺旋束未形成或不稳定。然而，在这种情况下，人们会期望在I3和L3轴上由无序的碳末端结构域产生类似的模糊(或缺失)密度，但事实并非如此。此外，HAdV-F41仍可预测形成螺旋线圈，即使螺旋更短(图S6，Lupas)。因此，I3分子的碳末端和L3分子的碳末端之间似乎有某种联系。解释缺乏明确密度的另一种可能性是，四螺旋束直接形成于L3三颗粒的顶部，但由于HAdV-F41中的柔性索结构域比BAdV-3中的更长(图3B)，盘绕的线圈不受与六边形塔的相互作用的约束，并且形成平均远离的可移动的尖峰状结构(图4C).这将类似于纤维远端部分的平均化，通过一根柔性轴连接到基底上。
剩下的一个问题是为什么四螺旋束不像在HAdV-C5和HAdV-D26中那样在小平面边缘形成，如果在所有三种病毒中绳状结构域的长度相似(图3B).有人提出，HAdV的蛋白ⅸ具有两个柔性弯曲，有助于其与六邻体轮廓的结合(图3B) (28).在HAdV-C5和HAdV-D26中，第一个柔性弯曲在中心三点的出口处引起绳索区域的顺时针转动。在HAdV-F41中，剩余地图指示转弯将改为逆时针方向(图4D).这种不同的路径可能是由第一个弯曲附近六邻体-九邻体相互作用的差异决定的。序列比对表明HAdV-F41中的索结构域比HAdV-C5和HAdV-D26中的短三个残基，缺失精确地位于两个弯曲(图3B).我们还观察到六邻体酪氨酸784当比较HAdV-F41和HAdV-C5六邻体结构(图2A和4E).HAdV-C5在这个位置也有一个酪氨酸，但是上游序列在两种病毒中非常不同，在HAdV-F41中有一个明显的苏氨酸三联体(残基781到783)。所有这些变化可能导致不同的相互作用，导致肠道病毒中的蛋白IX向不同的方向弯曲。因此，C端螺旋永远不会到达另一个已解决的HAdV形成线圈的位置。
蛋白质IIIa和VIII
HAdV-F41内部衣壳表面有少量外壳蛋白IIIa和VI8。蛋白质IIIa的五个拷贝位于每个顶点的下方，连接着五聚体和周围的六聚体(图1B)，并推测在组装过程中与包装蛋白相互作用(30).蛋白质IIIa追踪的范围和它的结构与HAdV-C5非常相似(表S2和S4)，其结构域组织如前所述(图5，A和B) (四).HAdV-F41蛋白IIIa在氮末端有一个八个氨基酸的插入，具有预测的α-螺旋结构(残基2-9；图5C)，这可以在周边区域形成额外的分子内相互作用，并有助于使顶点区域更加稳定。然而，我们没有观察到这种插入或在HAdV-D26(图5C) (6).与HAdV-C5的最大区别对应于连接GOS胶结构域和第八结合结构域的螺旋的第四和第五圈之间的纽结(图5，A和B) (四).这种扭结可能会导致顶点下相邻分子之间相互作用的差异(见下一节)。
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图5蛋白质IIIa和VIII。
（A)HAdV-C5 IIIa (PDB识别号:6B1T，链N)为黄色，HAdV-F41 IIIa为RMSD色的叠加，如图2。显示了GOS胶、连接螺旋、八键结合和核心近端结构域。（B)连接螺旋的细节，以显示其适合冷冻电磁图。（C)显示HAdV-C5、HAdV-D26和HAdV-F41中蛋白质IIIa序列比对的示意图。下面用不同的颜色显示了被跟踪的域。APD是在HAdV-D26中追踪的附属结构域，但在其他两种病毒中没有。HAdV-F41的氮末端延伸(额外的氮术语)和成熟切割位点(剪刀)也被指出。（D)橙色的HAdV-C5蛋白VIII (PDB ID: 6B1T链O)和RMSD着色的HAdV-F41 VIII的叠加。显示身体、颈部和头部区域，以及对应于成熟过程中切割的肽的间隙(剪刀)。（E)序列比对显示在HAdV-C5、HAdV-D26和HAdV-F41中被AVP切割的蛋白质八的两个中心肽(AVPa和AVPb)。氨基酸和平均成对同一性直方图配色方案与中的相同图2。
AdV二十面体壳的每个AU中存在两个蛋白质ⅷ的拷贝。其中一个与蛋白质IIIa相互作用，有助于稳定顶点，而第二个有助于保持小平面的中心板中的非周六邻体在一起(图1B).与HAdV-C5相比，HAdV-F41蛋白VIII在序列和结构上高度保守(图5D和桌子S2)。只有蛋白的中心区域被腺病毒成熟蛋白酶(AVP)切割31)，呈现序列发散(图5E参见下一节)。
蛋白质六和七以及其他内部元素
对HAdV-F41低温电磁图中至今追踪的分子未占据的密度[剩余密度(RD)]的分析揭示了几个感兴趣的特征(图6A).在六邻体三聚体中心腔的边缘，我们观察到不连续的弱密度(RD1)，与HAdV-C5相似，对应于肽pVIn和pVIIn2，在成熟过程中从前体蛋白pVI和pVII上裂解(5,8).由于缺乏有序性和低占用率，侧链在这些区域的定义很差，我们只初步追踪了四个拷贝的聚维酮和两个聚维酮2，在非盟的12个可能的对等地点中(图1B和6B和表S4()8).HAdV-F41中的蛋白VI比HAdV-C5(表S2)中的长，并且在其中心域(残基114至125)中具有肠道AdVs(物种A和F)共有的特定表位(32).然而，我们没有观察到任何可解释的密度，这种密度可以告知更长的六价键链和六价键之间的额外相互作用，或者HAdV-C5中的中心区域(5).
下载高分辨率图像在新选项卡中打开下载Powerpoint图6HAdV-F41衣壳的附加内部组件。
（A)左侧:一个面中的剩余密度(红色)，未被追踪的蛋白质六邻体(浅蓝色)、五邻体(浅粉色)、IIIa(黄色)或八邻体(橙色)占据。右侧:剩余地图组件，颜色编码为RD1至RD4(参见文本)。密度对应于轮廓为1.5σ的非共享地图。（B)蛋白质VI (pVIn，两个拷贝)和VII (pVIIn)的N末端肽2)暂时追踪在RD1，在六重腔内部。（C)剩余密度RD3和RD4的建议解释。除了右手边的插图，锐化地图中的RD显示为2.5σ。橙色薄带:蛋白质VIII的两个拷贝的描出部分(VIII顶点和VIII中心板)。橙色厚蠕虫:以未分配的密度模拟的多聚Ala肽被提议对应于第八代的中心肽。左图:可能是RD3中一个剩余密度的α螺旋形状。在RD4中，这个密度要弱得多，在RD4中，一颗黑色的恒星指示了它的位置。剪刀:蛋白质八中的AVP切割位点。肽pVIn被表示为灰色条带，其四个未被追踪的N末端残基的可能位置为黑色虚线。在RD3图中，IIIa连接螺旋是黄色的，在戊酮碱基蛋白(E 35)中追踪的第一个残基是粉红色的，粉红色虚线表示未追踪的34个残基的可能轨迹。右框缩放:IIIa连接螺旋以红色与HAdV-C5螺旋重叠显示，轮廓为1σ的非共享图显示为灰色网格，以强调与戊酮碱基氮末端臂相对应的低分辨率密度。
六邻体2、3和4之间的I3轴和L3轴处的L形密度(RD2图6A)也在HAdV-D26中观察到，但是它们的分配是不确定的(6).在HAdV-F41中，我们观察到另外两种以前的研究中没有报道的呼吸窘迫综合征(5,6).RD3和RD4位于蛋白质八的两个独立拷贝附近，形状相似，但RD3(位于喷顿区下方)密度更大。RD3和RD4都位于成熟过程中AVP切割留下的蛋白质ⅷ的缺口附近(图5，D和E，和6、A和C).在RD3中，我们可以模拟两种多丙氨酸肽。其中一个对应于21个残基的α-螺旋，而另一个是延伸的23个残基的肽(图6C，顶部)。这些长度与被AVP切割的pVIII肽的长度有很好的相关性(图5E).在HAdV-F41中，这些肽中的一个比HAdV-C5和HAdV-D26中的长6个残基，并且具有低序列保守性(图5E).在RD4中，密度较弱，只能模拟10个残基的延伸肽(图6C，底部)。我们假设RD3和RD4的至少一部分对应于蛋白质ⅷ的这些切除的肽，在HAdV-F41中，这些肽将是有序的，并加强内部衣壳表面(特别是顶点下方)的接触网络，因此有助于更高的衣壳稳定性。RD3和RD4也连接到对应于pVIn的密度，并且可以解释其未被追踪的前四个残基(图6C黑色虚线和S4表)。RD3中的碎片密度，RD4中不存在，似乎与第一个被追踪到的戊酮碱基Glu的残基有关35，与IIIa连接螺旋平行。我们认为这种密度对应于未被追踪的戊酮碱基的氮末端(图6C粉红色虚线)将与IIIa中扭结的连接螺旋相互作用，这种接触在螺旋没有扭结的HAdV-C5中不会发生(图5A)和戊糖碱基N末端序列的序列不同(图2D).
在AdV中确定弱的、不连续的密度斑块的身份是有问题的，因为有许多不遵循二十面体对称性的病毒粒子成分(包装蛋白、蛋白VI、蛋白IIIa的一半、切割肽和核心蛋白)，使得序列分配的组合问题极具挑战性且容易出错(8,30,33).然而，我们的解释表明，pVIII的中心肽、戊酮碱基的N末端和扭结的IIIa螺旋将以不同于先前在其他HAdV中观察到的方式合作加强HAdV-F41顶点区域。
讨论
HAdV物种F的窄肠向性尚未被很好地理解。传染性分析表明，与HAdV-C5不同，这些病毒不会被酸性环境灭活(14)，而赋予这种对低酸碱度抗性的主要因素似乎是短纤维，这是HAdV-F(18).在这里，我们表明HAdV-F41衣壳比HAdV-C5更耐热，需要更高的温度来打开并将其基因组暴露于溶剂中，并且在模拟的胃和肠条件下，传染性是稳定的，甚至是活化的。我们以近原子分辨率解决了HAdV-F41衣壳的结构，并对其进行了分析，寻找其趋向性和增强的物理化学稳定性的可能决定因素。
虽然六邻体和五邻体碱基的整体结构是保守的，但在与宿主因子相互作用的外环区域存在差异，这些因子可能在肠趋向性中起作用。HAdV-F41的六重环比HAdV-C5的六重环短得多，刚性也大得多。长酸性区域的缺乏反映了HAdV-F41的六邻体塔中没有大的带负电荷的斑块，并且在胃肠道的极端酸碱度条件下可能会影响与宿主因子的相互作用。然而，酸性伸展在HAdV-D26中也是不存在的，其具有眼向性，并且其中HVR1也被完全追踪(6).在penton base中，RGD图案被IGDD取代，带有它的环要短得多。RGD序列的缺乏也不是肠道嗜性的决定因素，因为这种基序存在于其他肠道AdV中，如HAdV-A31 (UniProtKB条目:D0Z5S7_ADE31)和HAdV-G52 (A0MK51_9ADEN)。尽管缺乏RGD基序，但最近表明HAdV-F41可以结合层粘连蛋白结合整联蛋白(34).
物种F中的AdV对人α-防御素的中和作用具有抗性，人α-防御素是在小肠中大量表达的抑制HAdV-C5感染的小阳离子抗菌肽(35).防御素与衣壳表面结合，防止脱壳，这种结合依赖于盐的浓度，表明存在静电相互作用(36).因此，人们很容易认为HAdV-氟对防御素的抗性与六邻体表面缺乏负电荷有关。为了支持这一假设，最近已经表明，在HAdV-C5六邻体HVR1中引入正电荷的突变赋予了对防御素中和的抗性(37).其他呼吸adv是否也是如此，还有待观察。物种A中的adv也具有肠道嗜性，缺乏酸性HVR1。RGD环也是防御素中和所必需的(37).HAdV-A的病毒携带这个环，而HAdV-F的病毒不携带，防御素对HAdV-A12产生适度的抑制(35).我们推测，六邻体中较短的碱性HVR1环与缺乏长RGD环的结合可能在确定F物种中HAdVs的肠道向性中起作用，帮助它们抵抗肠道防御素的中和作用。
病毒衣壳稳定性的确切分子基础很难解开，即使对于所谓的简单病毒(38).我们描述了一些在HAdV-F41和HAdV-C5中可能具有不同性质的分子间接触，但是很难断定这些差异是否会对衣壳稳定性产生影响，因为AdV病毒粒子中存在大量复杂的相互作用。然而，我们确实发现了部分有序的特征，表明在稳定顶点区域方面，五子碱基的氮末端、蛋白质IIIa、pVIn和八的切割肽之间存在合作。在外壳表面，蛋白IX三颗粒具有比HAdV-C5更强的疏水核心，而蛋白的其余部分是无序的，特别是在其碳末端缺乏四螺旋束。先前已经观察到，HAdV-C5中的四螺旋束容易受到干扰，当蛋白ix被碳末端融合修饰时变得无序(39)或抗体标记(40).在我们的HAdV-F41图中，九号染色体的碳末端区域缺乏明确的密度，这可能仅仅是由于样品制备过程中意外发生的部分断裂造成的。然而，在HAdV-C5螺旋束不明显的研究中，在其他衣壳位置没有观察到弱密度。图谱中序列和弱密度的差异支持HAdV-F41中存在蛋白ⅸ的组织，不同于其他AdV的所有描述。我们的观察还表明，有序螺旋束的形成并不是增强衣壳稳定性所必需的，这加强了三颗粒是蛋白质结合作用的关键部分的观点(29).此外，我们的模型表明，绳索结构域中看似微小的变化可能是衣壳中蛋白质九的结构发生根本变化的原因。最后，在我们的模型中，蛋白IX的碳末端从最外面的衣壳表面突出(图4，C和D)，这将使其成为外源肽插入的有趣场所，用于重定目标、表位展示或其它生物技术目的，如先前针对BAdV-3中的蛋白IX所建议的(41).AdV类型中蛋白质IX长度、序列和组织的变化表明，该蛋白质经历了与宿主相互作用引起的进化压力，并突出了其作为病毒-宿主特异性决定因素的潜在作用。
原文链接：/content/7/9/eabd9421
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