伊莎贝拉公主是葡萄牙国王曼努埃尔一世和王后玛丽娅的长女，玛丽娅是女王伊莎贝拉一世和国王费尔南多二世的第三个女儿。玛丽娅公主和她的两个姐姐一样，受过很好的文化教育，会卡斯蒂利亚语和拉丁语，还学习过音乐、舞蹈和宗教。玛丽成为葡萄牙王后以后，很少参与政治事务，在她的一生中，从没有停止过生育，间隔时期很短暂，这就影响了她的身体健康，最后在15的时候，生下孩子后，就去世了，终年34岁。尽管玛丽娅对待宗教很虔诚，表情比较严肃，但是生活不崇尚奢华。玛丽娅在宫廷中，大部分时间是花在缝纫和教育孩子上面，很少参与内政。不管怎样，曼努埃尔也很尊重她，在她怀孕期间，还赠送给她价值不菲的衣服和珠宝。
葡萄牙王后玛丽娅的画像
玛丽娅和曼努埃尔的长女伊莎贝拉出生于1503年10月24日，她的童年还是很愉快的。随着年龄的增长，这个小女孩逐渐长成为一个漂亮和聪慧的年轻女子。这位公主从小还学习了拉丁文、法语和西班牙语，以及基督教教义和文艺复兴的著作。作为那个时代的女子，她还喜欢阅读大量的书籍，据说伊莎贝拉拥有一个规模不小的图书馆，不过有不少是宗教书籍，主要是为了祈祷的用途。除了宗教书籍以外，她还喜欢阅读骑士类型的传奇和小说，这类藏书还占据了不少的数量。其实文艺复兴时期的人们，对于中世纪的传奇和小说，还是有着浓厚的兴趣。查理和伊莎贝拉的婚姻，不但有政治上的意义，而且还能建立深厚的感情。最终，查理还是选择了伊莎贝拉公主，她只比他小三岁，还能流利的说西班牙语。当时的条款是：葡萄牙公主伊莎贝拉嫁给查理；而她的哥哥胡安三世与查理最小的妹妹卡特琳娜结婚。
神圣罗马帝国皇后伊莎贝拉的画像
1526年3月10日，查理和伊莎贝拉在塞尔维亚的宫殿举行。据说，查理第一次见到伊莎贝拉，就被她所吸引住了。当时人的记录表明，在他们度蜜月的时期，一直在一起，也没有注意到周围的人们，他们边说边笑，没有什么能分散彼此的注意力“。查理在西班牙事务方面，需要伊莎贝拉帮助他管理，因此有时候是聚少离多，但是需要定期互相通信，这样可以更多的了解对方的一些情况。在管理西班牙事务方面，伊莎贝拉还是很能干的。1539年，5月，伊莎贝拉第七次怀孕，在第三个月的时候，出现了发烧的症状，导致了产前综合症，生下了一个死胎（是一个男孩）后，两个星期以后就去世了，时年35岁。从此以后，查理就没有再婚了，皇后去世以后，他要画家提香为他绘画几幅皇后的画像，其中的两幅作品，查理是始终带在身边的，后来进修道院，也是如此。
皇后伊莎贝拉 的画像
最初查理想要寻找伊莎贝拉的一幅肖像画，但是怎么也找不到。不过，查理听说，皇后以前曾经把一幅画送给了玛格丽特公主（腓力的妹妹，查理的姑母）。于是，查理的妹妹玛丽公主，知道以后，就把那幅唯一的肖像画送回来了，不过，查理认为与皇后的相貌有些差异，决定让他的朋友提香重新画两幅画：《葡萄牙的伊莎贝拉皇后的肖像》和《荣耀》。在这幅绘画中，提香使用了拉斐尔和达·芬奇经常使用的古典技巧，这个人物正好面对着一扇敞开的窗户，窗户那里有一处美丽的风景。这幅画中，蓝色和绿色的色调与内部环境所使用的暖色调形成强烈的反差。伊莎贝拉身穿深红色的裙子，金红色的锦缎，装饰有莱茵石的花纹。皇后胸前佩戴着一条珍珠项链，紧紧扣在左边；另一条珍珠项链，装饰有珠宝，挂在右边，这个名称当时就叫“珍珠泪”。伊莎贝拉的发饰，比较严谨，是把发辫编起来，在当时是比较时尚的。她的手中打开着一本书，可能是宗教书籍，正在全神贯注的注视着远方。
皇后伊莎内拉的画像，作于1548年，提香所绘
据说，伊莎贝拉被安葬到格拉纳达王家修道院，那里就是以前天主教国王的陵墓所在的地方。当时的贵族，法兰西斯·波吉亚，亲眼看到了美丽的皇后去世后的影响，他深受感动，“从此不再为世俗的统治者服务了。” 在1541年，法兰西斯·波吉亚的妻子去世以后，他辞去了自己的宫廷职务，最后成了一名耶稣派教士。腓力二世，根据查理生前的遗嘱，让伊莎贝拉和他合葬在一起。据说，后来的国王腓力四世，做了一些改动，结果与查理原先的愿望有些不一致了，就是把查理转移到国王神庙的墓地。
查理和伊莎贝拉的画像，作于十七世纪，由鲁本斯所绘。
