作者：李媛陈杰
来源：中华病理学杂志, ,48(8): 585-589.
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摘要近年来，免疫疗法已逐渐成为多种肿瘤的重要治疗策略之一，其中免疫检查点程序性死亡分子（PD-1）及其配体（PD-L1）备受关注。PD-L1是目前最常用的免疫疗效预测生物标志物之一。PD-1/PD-L1抑制剂用于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）的研究显示，肿瘤细胞中的PD-L1表达越高则疗效越好。然而由于PD-L1表达的时空异质性以及免疫组织化学检测自身存在的一些问题，将PD-L1作为非小细胞肺癌免疫治疗的预测生物标志物存在很大的挑战。该文就PD-L1检测在非小细胞肺癌诊治中的挑战进行了综述。
目前，在全球范围内肺癌的发病率和病死率仍居高不下，在中国和美国均高居癌症相关死亡原因的首位[1,2]。按照病理类型分类，肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer），其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%，约80%的患者在发现时已处于中晚期[3]。虽然近几年肺癌的诊治已取得较大进展，例如肺癌的微创诊断和治疗、放射治疗和分子靶向治疗等，但非小细胞肺癌患者的5年生存率仍然较低（仅17.4%）[4]。
近年来，免疫疗法已逐渐成为多种肿瘤的重要治疗策略之一[5]，其中免疫检查点程序性死亡分子（programmed death 1，PD-1）及其配体（programmed death-ligand 1，PD-L1）受到了很大的关注。PD-1属于CD28家族，是表达于活化T细胞、B细胞和NK细胞表面的关键免疫检查点受体，在肿瘤免疫逃逸中发挥关键作用[6]。PD-L1是PD-1的主要配体，研究显示PD-L1在不同类型的肿瘤如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等中均有上调[7,8,9]。PD-L1与PD-1结合可抑制免疫细胞的免疫功能从而导致肿瘤免疫逃逸，而拮抗PD-L1与PD-1的结合可阻断负向调控信号从而可增强机体的内源性抗肿瘤免疫效应[10]。因而，肿瘤PD-L1表达水平可作为潜在免疫治疗效果的预测生物标志物，其应用价值在近年的研究中备受瞩目。
通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测PD-L1的表达水平是目前判断非小细胞肺癌患者是否适合使用免疫检查点抑制剂治疗以及能否从这种治疗中得到更多获益的主要评估手段。因在检测过程中存在多个亟待解决的问题，PD-L1检测仍然面临诸多挑战，如不同单抗和IHC染色平台的使用、PD-L1染色阳性截断值的设定、待评估的细胞类型（肿瘤细胞或免疫细胞）、肿瘤的异质性和组织样本采集的时间等，这些因素均会对结果造成影响。
一、伴随诊断和补充诊断
迄今已有5种PD-1/PD-L1抗体免疫药物上市，其中纳武利尤单抗（nivolumab）、帕博利珠单抗（pembrolizumab）和atezolizumab已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于非小细胞肺癌患者的治疗。上述3种PD-1/PD-L1抗体均可用于晚期非小细胞肺癌患者的二线治疗，同时帕博利珠单抗也可用于PD-L1表达水平≥50%且无表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变、无间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）基因重排非小细胞肺癌患者的一线治疗，以及与化疗联合用于转移性非小细胞肺癌患者（鳞癌与无EGFR基因突变或ALK基因重排的非鳞癌）的一线治疗（无需检测PD-L1表达水平）[4]。另外，纳武利尤单抗是首个获中国国家食品药品监督管理总局（SFDA）批准治疗非小细胞肺癌患者的PD-1抗体，可用于EGFR基因突变阴性和ALK基因重排阴性、既往接受过含铂方案化疗后疾病进展或不可耐受的局部晚期或转移性非小细胞肺癌成人患者。
由于PD-1/PD-L1抑制剂的作用机制是通过激发患者自身的免疫系统来实现抗肿瘤作用，因此疗效因人而异。目前，FDA将用于免疫治疗有效性判断的诊断方法分为"伴随诊断"和"补充诊断"两种。伴随诊断对于接受相应药物治疗是必须进行的检测，能够为治疗用品的安全性和有效性提供必要信息[11]。伴随诊断的优点在于可基于预先设定的截断值将患者严格分为两部分，即生物标志物阳性和阴性患者，生物标志物阳性患者才能用药，以保证患者在安全用药的基础上获得最大的临床获益机会。
补充诊断对于接受相应药物治疗不是必须的检测，但可以提供个体治疗相关的信息。作为一种有助于治疗产品使用的利益-风险决策检测，补充诊断可根据检测结果筛选对治疗药物可能有积极反应的患者，但在检测结果为阴性的情况下使用药物也能获益[12]。与伴随诊断不同，在是否使用相关药物治疗的决策上，补充诊断并非必须[13]。表1列举了目前与非小细胞肺癌免疫治疗相关的药物以及伴随/补充诊断产品。
表1
非小细胞肺癌免疫治疗相关药物及伴随（补充）诊断
二、不同PD-L1检测试剂盒之间的差异
目前FDA已批准5种标准化的PD-L1检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD-L1 IHC 28-8 pharmDx、22C3 pharmDx、73-10试剂盒以及配套Ventana检测平台的PD-L1 IHC SP142和SP263试剂盒[13]。在既往的一系列随机对照临床研究中，商用试剂盒累积了大量循证医学数据，并形成了规范的标准化流程和严格的质量控制标准。因此，商用试剂盒具有结果可靠、可重复性强、使用简便等特点，便于相应药物的规范临床操作。但由于PD-L1染色抗体多种多样，不同抗体在不同研究中的灵敏度和亲和力不同，PD-L1染色阳性的截断值和IHC染色平台的不同均会使PD-L1检测存在差异，使得不同检测方法之间的可比性存有争议。PD-L1蓝印计划1[14]比较了不同检测试剂盒、检测平台测定非小细胞肺癌肿瘤样本PD-L1表达的准确性和可靠性差异，结果显示：28-8、22C3和SP263试剂盒检测肿瘤样本的PD-L1表达水平相似，而SP142检测的PD-L1水平偏低。SP142除了对肿瘤细胞评分外，还需要对免疫细胞评分，其评价肿瘤区域内有任何强度的PD-L1染色的免疫细胞所占面积的百分比，这一评分标准对病理医师的判读过程造成一定难度。蓝印计划1比较了4种抗体在免疫细胞染色的情况，结果显示28-8、22C3、SP263和SP142均可以在免疫细胞表达，但即使在有经验的病理医师中对免疫细胞的PD-L1表达判读的一致性仍较低。德国一致性试验对15例非小细胞肺癌肿瘤标本进行分析[15]，发现28-8和22C3检测的肿瘤细胞PD-L1表达水平相似，SP142低于28-8、22C3和SP263，SP263则高于28-8、22C3和SP142。最近发表的蓝印计划2使用81个不同组织学和样本类型的肺癌标本，应用全部5个PD-L1检测试剂盒（22C3、28-8、SP142、SP263和73-10）进行染色，并由25位病理医师进行判读。结果显示，22C3、28-8和SP263的PD-L1检测结果具有高度可比性；SP142检测灵敏度较低；而73-10检测PD-L1在肿瘤细胞上表达的灵敏度更高。5种检测试剂盒在肿瘤细胞PD-L1评分效度的评估显示了很强的可信度[组内相关系数（ICC）=0.86~0.93]，在细胞PD-L1状态评估上的一致性较好（ICC=0.78~0.85）。蓝印计划2的研究结果进一步巩固了22C3、28-8和SP263检测可互换的分析证据，而SP142检测PD-L1的表达偏低，73-10检测PD-L1的表达偏高[16]。
限于不同国家/地区病理科与实验室的客观条件与探索性研究需求（如商用试剂盒的可及性、检测平台不通用、试剂盒价格高等），在许多国家/地区也出现了不少PD-L1实验室自建检测方法（laboratory developed test，LDT），并成为商用试剂盒应用受限地区的一种替代选择[17]。但从一致性研究结果看来，大部分LDT仍存在质量控制无法达到商用试剂盒标准，或检测一致性低于商用试剂盒（<75%达标线）的问题[18,19,20]。LDT中一抗不受检测平台限制，可通过探索获得抗体与平台的最优组合，从中筛选出部分质控和一致性达标的优化条件，可作为不具备商用试剂盒检测条件地区和实验室的备选方案。
三、PD-L1的异质性和动态变化
PD-L1的表达在不同患者甚至同一患者的病灶内不尽相同，这种PD-L1表达的异质性是限制其作为肿瘤生物标志物的重要原因之一。由于肿瘤细胞和免疫细胞均可表达PD-L1，而浸润在肿瘤内和肿瘤周围的免疫细胞是异质的，免疫细胞可位于肿瘤的不同区域并以不同密度分布[21]。一项针对肺鳞癌PD-L1表达水平的临床病理分析显示，PD-L1高表达的鳞癌组织始终表现出CD8阳性T细胞浸润增多[22]。肿瘤细胞PD-L1表达有集中表达和分散表达两种形式，因此肿瘤细胞PD-L1表达的固有异质性也可部分解释临床试验中观察到的PD-L1表达差异。如一些被判断为PD-L1阴性的肿瘤可能仅在活检部位为阴性，而在另一位置为阳性[23,24]。而由于活检是有创的，临床上通常只进行几个点的活检，因此不一定能全面反映患者肿瘤组织的PD-L1表达情况。对于PD-L1表达阴性的患者仍可从PD-1/PD-L1抑制剂治疗获益，可能是由于PD-L1表达的异质性而导致活检标本假阴性。
此外，随着疾病的进展和各种治疗（免疫治疗、化疗或放疗）的进行，PD-L1的表达可能会随时间推移而发生变化。研究表明，肺癌患者在接受放疗后PD-L1的表达水平总体上升[25]。黑色素瘤患者肿瘤细胞和巨噬细胞的PD-L1表达水平在帕博利珠单抗治疗早期可增强[26]。因此，通过PD-L1表达的变化了解患者对不同方案的治疗反应显得很有意义，而且这些结果也进一步强调了动态监测PD-L1表达水平的必要性。
四、样本对PD-L1检测结果的影响
取得合适的样本是有效评估PD-L1表达水平的关键步骤。研究表明，PD-L1表达受样本大小、样本类型、活检部位、肿瘤和免疫微环境的不同成分以及肿瘤转化等因素的影响。
1．样本采集方法：
有几种技术可供选择，包括柔性支气管镜检查、计算机断层扫描（CT）引导穿刺活检和支气管内超声引导下经支气管针吸活检（EBUS-TBNA）[27,28]。所有这些方法可以诊断超过85%的肺癌，并发症发生率低。近年来，EBUS-TBNA已逐渐成为肺癌的主要诊断和分期工具，并且由于其安全性和有效性良好，现在认为EBUS-TBNA是肺癌组织重复取样的最有效方法[29]。目前有一项评估EBUS-TBNA标本能否适用于PD-L1状态检测的研究正在进行中[30]。
2．肿瘤内和肿瘤间异质性：
手术切除或活检样本可取自原发或转移性肿瘤内的不同部位。如前所述，PD-L1的表达具有异质性，因而样本采集部位对于PD-L1表达评估的准确性和全面性至关重要。Gniadek等[31]使用SP142对150个取自手术切除样本的原发癌（79个鳞癌和71个腺癌）石蜡包埋块的不同区域进行组织芯片染色（每个肿瘤4个）。结果显示，对于腺癌，PD-L1表达评分>50%和>1%的微阵列敏感性分别为85%和87%，对于鳞癌则分别为95%和90%。Sakakibara等[32]分析了采用EBUS-TBNA评估肺肿瘤细胞PD-L1表达的效用，经比较，EBUS-TBNA结果与手术切除的淋巴结转移组织（r=0.93，n=5）、经支气管活检组织（r=0.75，n=16）和相应的手术切除原发肿瘤（r=0.75，n=6）具有良好的一致性；但经手术切除的原发肿瘤与淋巴结转移组织（r=0.49，n=47）或经支气管活检组织（r=0.52，n=41）之间的一致性水平较低。ATLANTIC试验[33]评估了肿瘤间异质性并报告原发和转移性样本的肿瘤细胞PD-L1染色结果相似（35%比33%，一致性89%）。肿瘤细胞中的PD-L1表达由多种机制诱导，包括通过内源性致癌信号转导和通过肿瘤浸润性免疫细胞分泌的细胞因子诱导。这表明原发性和转移性非小细胞肺癌中的PD-L1表达可能以不同方式调节，导致原发和转移性病灶之间的PD-L1表达差异[34]。
3．新鲜组织和存档标本：
样本采集后的检测时间和切片存储时间会影响IHC染色结果。研究发现，组织蜡块的储存时间与PD-L1表达水平相关，存储时间<3个月、3个月至1年以及1~3年这3个时间段内的样本PD-L1表达水平相似（30%），而存储时间>3年的样本PD-L1表达水平明显下降（13%）[33]。KEYNOTE-010研究中[35]最先使用存档样本测量非小细胞肺癌的PD-L1表达，但研究人员对方案进行修订后新入组了一批新鲜样本，对存档样本（n=456）和新鲜样本（n=578）PD-L1表达情况的再分析结果显示，两组样本中肿瘤PD-L1表达水平≥50%的比例相似（40%比45%），两组中PD-L1高表达患者的临床结局也相似。ATLANTIC试验[33]是一项在铂类难治性非小细胞肺癌患者中应用durvalumab治疗的Ⅱ期研究，评估了近期（<3个月）和较早（3个月至1年、1~3年和>3年）获得的肿瘤样本（112例患者）中的PD-L1表达情况。与最近获得的样本相比，≤3年存档样本之间的一致性较高（76.2%）。尽管病例数量有限，但这些数据表明≤3年的存档样本适用于PD-L1评估，已接受过抗癌治疗的患者在进行PD-L1表达的临床评估时可能无需再次活检，这也在很大程度上减轻了患者的痛苦。
4．组织学和细胞学样本：
目前仅有组织学样本被批准用于PD-L1检测，这使得一些病理医师对使用细胞学样本进行PD-L1检测持谨慎态度。然而，大约1/3的肺癌患者的诊断是通过微创手术获取的细胞学材料确立的，因此，细胞学和组织学样本的一致性或影响细胞学样本作为PD-L1表达评估的实际临床应用。Skov和Skov[36]使用28-8和22C3方法比较了86个配对的肺癌细胞学样本和蜡块包埋组织的PD-L1表达水平，他们观察到组织学和细胞学标本之间具有较高的一致性（85%~95%）。但在一致性不佳的几对样本中，PD-L1的表达在组织学样本中的异质性更明显，尤其是表达水平≥5%和≥10%的样本。以上数据表明，当无法获得组织学样本时，可尝试使用经处理的细胞学样本作为PD-L1表达评估的方案，但其可靠性仍需要更多循证医学证据证实[16]。
五、总结与展望
免疫疗法是近几年肿瘤治疗研究领域的热点，其中PD-1/PD-L1检查点抑制剂在肺癌治疗中取得了令人瞩目的成果。为了使更多接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的患者获益，寻找有效的预测性生物标志物刻不容缓。虽然PD-L1是目前最常用的免疫疗效预测标志物，但由于检测技术的差异以及PD-L1表达的异质性和动态变化等特点，使PD-L1检测仍存在一定局限性。研究数据也显示，单独使用PD-L1表达水平预测有效性的结果不尽如人意。随着研究的深入，将PD-L1与肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷和肿瘤免疫微环境等因素进行整合，以筛选出最适合的治疗人群，将是免疫治疗个体化和最优化的必然选择。
