荧光成像是生物学研究领域应用最广的成像技术之一。生物体的一些组分对可见光波段有较高的吸收或散射（如黑色素500-520nm，血红蛋白504-540nm)，在650nm以上自发荧光则逐渐降低，非特异性组织吸收率降低。
图1近红外荧光波长范围内自发荧光影响弱(a)，穿透深度强(b)
相对于传统的可见光波段荧光成像，近红外荧光成像技术是一种新兴的体内成像方法，其使用的荧光染料波长为650～900 nm,具有更高的信噪比，此外近红外光可进行更深层的成像，生物组织在近红外附近光吸收较弱;而且相对于可见光，近红外光的衰减长度更长，意味着在组织内穿透力更强[1]。
一项对于脑血管的研究显示，用近红外染料Alexa680-Dextran标记小鼠脑血管，结合双光子荧光显微镜1280nm激发，可实现毫米级的高分辨率荧光成像[2]。
图2.毫米级小鼠脑血管成像
伴随各种光学成像技术，如共聚焦显微镜、多光子显微镜、光片显微镜、小动物成像仪的进展与研发，近红外荧光探针和蛋白标记的近红外成像，尤其是小动物近红外成像在肿瘤生物学等领域发挥着广泛而巨大的作用，不论是基础研究，还是临床诊断，亚型鉴别，以及后期的药物筛选精准治疗，预后评估等各个方面。
近红外染料由于其独特的优势，发展十分迅速，合理使用可使我们的研究从传统可见光的二维成像向高信噪比的近红外深度三维成像过渡，去发现一片深层的红色天地。
近红外染料五花八门，数以千种，数量繁多，目前的研究中通常分为以下几类：
无机近红外荧光材料（包括单壁纳米碳管、半导体量子点、稀土纳米材料等）
有机近红外染料（包括菁类染料、BODIPY类、罗丹明类、方酸类、卟啉类）
近红外荧光蛋白（IFP2.0，miRFP703）等
近红外染料通过商业购买或者实验室合成都能够轻易获取，可选择性十分广阔，详细了解每一种染料的优缺点对我们的选择至关重要。下面为大家简单介绍几类最经典的试剂，为染料的选择拓展至更大范围。
菁类染料
菁类染料是一类优良的荧光染料，其中吲哚菁绿（indocyanine green, ICG， Ex807nm、Em822nm）是一种典型的花菁类近红外染料，是美国FDA批准的可用于临床的近红外染料，由于具有较好的光稳定性和生物安全性，也和另一种近红外染料亚甲基蓝（MB，发射波长约700nm）广泛应用于临床，极大推动了生物医学的发展。
ICG和MB均已被广泛用于基于近红外光谱的手术成像，用于包括可视化的血管、淋巴管、胃肠道、胆管和输尿管等结构成像和心脏灌注功能成像，还有术中图像引导下的病变组织切除。此外为了克服早期ICG特异性、靶向性不高的缺点，科研人员合成了一系列具有两性离子结构且以700nm、800nm为中心的荧光发射波长的新型近红外荧光载体（分别命名为ZW700和ZW800），两性离子的特异性结合提高近红外荧光的靶向性，从而使得成像具有更好的信噪比。ICG以及各种修饰改进后的ICG类染料，仍被广泛应用在临床诊断和科学研究中，尤其是肿瘤的检测及药物开发。
图3 近红外染料应用于小鼠脑血管深度成像[3]
图4 近红外染料应用于肿瘤成像[3]
甲川菁类也就是常见的Cy系列（如Cy5 Cy7 Cy7.5）也是一类常用的菁类近红外有机染料分子，其中 Cy5的激发波长在645nm，其发射在664nm， Cy7在Ex747nm, Em774nm。相比普通可见光荧光染料，Cy系列菁染料具有更高的摩尔吸光系数，光亮度更高，光稳定性强,染料的毒性小，被广泛应用于标记细胞以及偶联至各种抗体分子标记各类蛋白，此外由于细胞和组织在近红外的自发荧光更小，Cy系列的菁染料也非常适合做活体小鼠荧光成像的研究。
罗丹明类
罗丹明这个名字对于接触成像的科研工作者肯定是耳熟能详了，它其实也属于近红外有机染料中的一大类，其中最经典的罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明101的吸收和发射波长是在可见光区域的500-600nm。为了更适应生物荧光成像，科学家通过改变其结构和偶联元素使其吸收和发射红移，进而衍生了一系列新型近红外罗丹明染料，如Si-罗丹明(SiR)、Ge-罗丹明(Ge-R)和Sn-罗丹明(SnR)等，其中根据最佳激发波长不同，还可细分至：SiR650（Ex646nm、Em660nm）、SiR680(Ex674nm、Em689nm)、SiR700(Ex691nm、Em712nm)等。
Fluoresence Dyes
Excitation
Emission
Alexa 680
679nm
703nm
Indocyanine green ICG
807nm
822nm
MB
665nm
686nm
ZW800
772nm
788nm
Cy5
646nm
664nm
Cy7
747nm
774nm
Cy7.5
788nm
808nm
SiR650
646nm
660nm
SiR680
674nm
689nm
SiR700
691nm
712nm
IFP1.4
684nm
708nm
IFP2.0
690nm
711nm
miRFP
674nm
703nm
新型罗丹明染料保存了传统罗丹明染料良好的水溶性、高量子产率和耐光漂白性的优秀性能，又集成近红外的优势，已被广泛运用于各种细胞的荧光成像。
此外，科学家还研究得到的一类同时具有罗丹明结构和菁类结构的新型近红外荧光染料——CS NIRs，集两类染料优点于一身的新型染料，不失为荧光染色标记的优良选择。
近红外荧光蛋白
除了各种近红外荧光染料分子，近红外荧光蛋白同样也得到长足发展和广泛应用。，因GFP荧光蛋白而获得诺贝尔化学奖的钱永健(Roger Tsien)教授，所在实验室在Science杂志上报导了第一个可用的近红外光敏素荧光蛋白[4]，研究者从抗辐射奇异球菌Deinococcus radiodurans中选择了光敏素与生色团结合区域，通过特异性突变，得到了第一代近红外荧光蛋白IFP1.0。后续又进一步优化得到了更加稳定的新版本IFP1.4，亮度是IFP1.0的4倍，其激发光波长为近红外的684nm，发射光波长708nm。在此基础上，一系列近红外荧光蛋白相继涌现，如果实验室具备开展各种分子生物学技术的条件，就像广泛运用GFP一样，通过转基因的标记，结合共聚焦，双光子，光片照明显微镜、红外成像仪等三维荧光显微成像技术，也能玩出一片红色天地。
近年来近红外蛋白已被广泛应用于多色荧光成像、光遗传学、光转换，光激活、FLIM-FRET蛋白相互作用等各方面荧光成像的研究[5]。此外，，超高分辨率荧光显微成像技术荣获诺贝奖，我们完全有信心相信更多近红外荧光蛋白继续改进和开发，会为我们带来更多、更深、更细的红色信号，助力推进近红外荧光成像更广泛的应用。
总而言之，各种近红外染料、蛋白的继续开发和改良，不仅会推动各种荧光成像技术和仪器的更快速发展，也必定能推进深层分子成像、肿瘤学、光遗传学、神经科学等领域的继续前进，为临床疾病的精准诊断、后期动物药理学试验以及靶点开发等诸多方面带来福利。
参考文献：
M. M. Karasev et.al. Near-Infrared Fluorescent Proteins and Their Applications Biochemistry (Moscow), ,
2、Erich E et.al. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics
3、 Hong,Hongjie Dai et.al. Near-infrared fluorophores for biomedical imaging NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING
4、 X Shu et.al., Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome. Science,
5、SHcherbakova.et.al Near-infrared fluorescent proteins engineered from bacterial phytochromes. Curr.Opin.Chem.BIO.27,52-63
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