细胞因子作为历史上第一款被FDA批准的肿瘤免疫治疗药物 (IFNα, 1986 & IL-2, 1992/1998)【1】, 其后的发展并不顺利。细胞因子是一种小的，可溶性的信号蛋白，作为对严谨但低效的细胞直接接触或多重信号调控机制 (“静”“慢”) 的补充，细胞因子能够直接并且快速的启动免疫反应 (“动”“快”) 应对紧急的信号。
从最早期抗病毒的干扰素家族，到引起炎症和激活淋巴细胞的“monokine”和“lymphokine”等，细胞因子几乎参与了所有的细胞反应，尤其调控着免疫细胞或者非免疫细胞的生长、发育、分化和效应功能。这些功能对于免疫系统和免疫细胞在对抗病原菌入侵和肿瘤的过程中至关重要。但是，细胞因子因其多能性 (pleiotropic)、冗余性 (redundant)、不同的产生来源 (resource) 和作用终端 (destination)，以及其作用的多种方式 (autocrine, paracrine & endocrine)，编织了一张复杂的细胞因子网络。
同时，细胞因子的高效性让自然进化了严格的负调控机制，大大削弱了其生物学功能。这些因素导致细胞因子治疗容易产生各种副反应，药物耐受度低和高毒性，使得天然的细胞因子并不适合作为可以利用的药物靶点【2】。近年来，利用定向进化等手段精确的“设计”和改造细胞因子从而去除其不利的生物学特性，成为该领域新的亮点【3-5】。
6月24日，Nature杂志发表了耶鲁大学Aaron Ring课题组以周挺博士为第一作者的研究文章：IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy，首次报道了IL-18的天然假受体IL-18BP作为一种新的可溶性的免疫检查点抑制了其抗肿瘤功能，并通过定向进化手段将IL-18改造成不结合假受体但保有信号传导功能的DR-18(decoy-resistant IL-18)，显示了良好的抗肿瘤效果。
为了寻找特异作用于肿瘤微环境的细胞因子，作者通过分析肿瘤浸润淋巴细胞单细胞测序数据和免疫学实验发现，IL-18及其受体 (IL-18Rα/Rβ) 在激活的CD8 T和自然杀伤 (NK) 细胞中特异高表达，暗示了IL-18通路对肿瘤杀伤效应细胞功能的影响。
IL-18作为IL-1家族的重要促炎因子【6】，主要由巨噬细胞、树突细胞和上皮细胞分泌。它在细胞内以非活性前体 (inactive pro-form)的形式存在，在炎症发生时能够被炎症小体中caspase-1切除前体肽而迅速释放，是NLRP3和NLRP1炎症小体下游的重要效应分子。它结合其异源二聚体受体 (IL-18Rα/Rβ) 介导了MyD88-NFκΒ信号通路。IL-18的主要功能之一是刺激NK细胞和抗原配对过的淋巴细胞产生γ干扰素【7】。由于其免疫激活功能，IL-18曾经被应用于肿瘤免疫治疗，但在二期临床试验中以失败告终【8】。
作者研究发现临床病人在接受多次IL-18治疗后药效逐渐减弱，同时体内大量诱导产生IL-18结合蛋白 (IL-18BP)【9】。IL-18BP是IL-18的假受体 (decoy receptor)和天然抑制剂，它以超高亲和力 (1.1pM) 结合IL-18并阻止其与受体结合【10, 11】。随后，作者通过免疫组化等手段证实了IL-18BP在人类癌症组织（图1a）和血清中（图1b）广泛表达，并用Il18bp-/-小鼠模型显示了其抑制IL-18的抗肿瘤功能（图1c）。
图1. IL-18BP在肿瘤中高表达同时抑制IL-18抗肿瘤功能
基于以上发现，作者应用蛋白质定向进化和酵母展示改造IL-18成为只结合IL-18Rα但不结合IL-18BP的突变体DR-18(decoy-resistant IL-18)。通过分析IL-18与IL-18Rα/Rβ和IL-18BP的共同结合面鉴定了重要的共用结合位点 (图2a)，然后使用简并密码子构建突变体库并展示在酵母表面 (图2b)，通过控制IL-18Rα/Rβ和IL-18BP的浓度结合磁珠和流式细胞仪多次迭代分选，筛选出所需的DR-18突变体 (图2c)。重组表达的DR-18突变体在体外实验中显示了其信号激活但同时抵抗IL-18BP抑制的功能 (图2d)
图2. 定向进化改造IL-18拮抗IL-18BP
改造后的DR-18在多种动物肿瘤模型中 (MC38, YUMMER1.7, B16-F10, CT-26, 4T-1, EMT6, A20, etc)显示了良好的单药治疗效果，同时也能和免疫检查点抑制剂anti-PD-1联用产生协同效应 (图3a, MC38模型)。
随后，作者通过单细胞测序对比分析了PBS, 野生型 (WT) IL-18和DR-18给药后的肿瘤微环境，发现DR-18将肿瘤浸润CD8 T细胞激活成大都高表达效应分子和共刺激分子的强效应细胞群 (cluster CD8_1, TEFF)，而其他两项对照组却以耗竭CD8 T细胞群为主 (cluster CD8_2, TEX) (图3b)。同时，DR-18处理的CD8 T细胞中还包含了高表达细胞分裂相关基因以及中等水平PD1和转录因子TCF1的记忆前体群 (cluster CD8_4/5, TG1S+G2M) (图3b)。
图3. DR-18激活CD8 T细胞功能去除肿瘤
进一步的免疫学实验证实，DR-18能够促进淋巴细胞浸入肿瘤，尤其是激活的CD8 T和NK细胞具有强烈的效应功能 (poly-functional)，能同时分泌多种效应分子。
近年来，T细胞发育研究中鉴定了一类重要的记忆前体细胞 (CD44+PD1+Tim3-TCF1+)【12】，它具有自我更新的类似干细胞功能，同时能分化成终端效应T细胞。这种细胞是免疫检查点抑制剂作用的主要效应细胞群，对于持久免疫反应至关重要。
作者发现，DR-18在增强终端效应T细胞 (PD1+Tim3+)的比例和功能外 (图4a)，还能够大量扩增高表达TCF1的记忆细胞前体库 (图4b和4c)且阻止其向高表达TOX的耗竭T细胞分化 (图4d)。
图4.DR-18促进肿瘤浸润CD8 T细胞分化
以上的结果显示DR-18能够激活肿瘤浸润CD8 T细胞，但其是否是必需的呢？作者发现使用Rag2-/-老鼠、抗体删除CD8 T细胞 (图5a) 或者Il18r1-/-老鼠 (图5b) 都将使DR-18抗肿瘤功能丧失，说明DR-18的效应依赖于CD8 T细胞和IL-18受体。
进一步细胞回输实验发现，从Il18r1-/-老鼠中分离的T细胞输入Rag2-/-老鼠，不能够挽救DR-18的功能，而从WT老鼠中分离的带有IL-18受体的T细胞则能够在Rag2-/-老鼠中恢复DR-18的抗肿瘤效果 (图5c)，证实DR-18引起的免疫反应是DR-18直接作用于CD8 T细胞的结果。
图5. DR-18直接作用于表达IL-18受体的CD8 T细胞
最后，为了研究DR-18激活NK细胞的功能对于肿瘤免疫的重要性，作者还通过CRISPR/Cas9构建了B2m-/-肠癌和黑色素瘤老鼠模型。B2m缺失导致MHC class I对于CD8 T细胞抗原递呈的失效是肿瘤耐药性的一个主要原因，这种模型对免疫检查点抑制剂完全免疫，但DR-18仍然能够通过促进NK细胞的分化和效应功能从而显示出良好的抗肿瘤效果。
目前DR-18全球专利 (US0070262A1) 在获批，临床前各项试验和药品生产目前几近完成，研究型新药申请 (IND) 将在底递交，一期临床试验将在开展。
包括IL-18BP在内的免疫检查点蛋白作为肿瘤免疫治疗药物的热门靶点，在维持免疫稳态，预防自身免疫疾病方面发挥了重要作用。在癌症中，免疫检查点机制的激活会抑制抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤细胞从人体免疫系统中逃脱存活下来。因此，抑制免疫检查点，激活免疫细胞重新工作从而消灭肿瘤细胞，成为了肿瘤免疫治疗研发的重要方向。南模生物作为一家专注于模式生物领域的高新技术企业，可提供包括IL-18BP在内的各类免疫检查点基因修饰小鼠和包括IL-18在内的各类细胞因子基因修饰小鼠模型，这些模型涵盖敲除、示踪及人源化等各种类型。以IL-18及其受体为例，南模生物就构建了如下模型：
品系验证数据示例：
Il18-(Luc-EGFP)
图6. 活体成像检测IL18的表达情况。LPS处理0,1,3,5小时，体外观察lucififerase的表达。荧光素酶的表达强度反映了IL18的激活程度，可以在活体中实时跟踪炎症因子IL18 ，实现表达模式的可视化。
参考文献
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