为了保证肉鸡的健康快速生长，生产中常大量使用具有促生长作用的抗生素。然而，抗生素的大量使用同时带来细菌耐药性增加等负面效应，因此越来越多的国家开始限制抗生素的使用[1-2]。在禽类生长中，抗生素主要作用是提高禽类生长性能并保护肠道健康从而抑制腹泻等疾病发生[3]。因此，如何选择和应用具有以上功能的抗生素的替代品成为肉禽养殖业亟须解决的问题之一。
丁酸钠具有提高肉鸡生长性能和促进肠道健康的作用。它主要通过改善肠道微生物组成、缓解炎症、提高免疫力以及促进肠道屏障功能等途径发挥上述作用[4-9]。
益生菌如丁酸梭菌等同样由于可改善肠道微生物组成，可以作为抗生素的替代品对肉鸡生长性能发挥积极作用[10-12]。此外，已有研究报道，益生菌与酶制剂（木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶等）具有协同作用，可以提高肉鸡饲料利用率、肠道健康和生长性能[13]。但是，目前关于早期丁酸钠营养干预及其与益生菌、酶制剂联合应用对肉鸡生长性能、肠道健康和肠道微生物组成的研究较少。因此，本试验研究了早期添加丁酸钠以及早期添加丁酸钠，且全程添加益生菌和酶制剂对白羽肉鸡生长性能、肠道形态结构、肠道氧化应激反应、炎性因子和紧密连接蛋白基因表达以及肠道微生物组成的影响，以期为丁酸钠、益生菌和酶制剂在肉鸡生产中的联合应用提供参考。
1 材料和方法1.1 材料与试验设计试验方案经中国科学院亚热带农业生态研究所（中国长沙）动物试验方案管理与评审委员会批准，按照动物保健和福利的指导对肉鸡进行照料和屠宰。试验从肉鸡孵化场购买刚出雏的AA白羽肉仔鸡2 100只，随机分配到3个处理组：对照组饲喂基础日粮；丁酸钠组，第1~14 d在基础日粮中添加0.1%的丁酸钠，然后饲喂基础日粮；复合组，第1~14 d在基础日粮中添加0.1%的丁酸钠，全程在基础日粮中添加0.02%益生菌和0.05%酶制剂。每个处理10个重复，每个重复70只肉鸡。整个饲养期为42 d。试验各阶段基础饲粮在参照NY/T 33—的基础上，结合生产实践配制，其基础日粮组成营养水平见表1。进鸡时，前3 d圈舍温度保持33 ℃，随后逐渐降低，在21 d时，温度保持23 ℃，此后保持该温度到试验结束。全期自由采食和饮水。丁酸钠、益生菌和酶制剂（罗酶宝，优越型复合酶AP10）均由安迪苏生命科学制品（上海）有限公司提供。益生菌主要成分为枯草芽孢杆菌制剂，有效含量2.0×109 CFU/g；酶制剂主要成分为木聚糖酶和β-葡聚糖酶，酶活单位分别是木聚糖酶大于等于2 200黏度单位/g，β-葡聚糖酶大于等于200 AGL单位/g。
1.2 生长性能与死亡率分别于0、21、42日龄以重复（栏）为单位称重，计算生长前期（1~21日龄）、后期（22~42日龄）和全期（1~42日龄）各重复的平均日增重。记录试验全程采食量和死亡鸡只数，以重复为单位计算阶段平均日采食量、料肉比和死亡率。
平均日采食量=总采食量/（天数×只数）料肉比=平均日采食量/平均日增重死亡率=死亡数/总只数1.3 样品采集试验第42 d肉鸡称重后，每个重复选取3只体重适中的肉鸡并屠宰，分离回肠（近盲肠）取2 cm左右固定于10%的福尔马林溶液，用于观察肠道组织形态。收集回肠样品液氮速冻后，保存于-80 ℃，用于测定肠道氧化还原状态指标和相关基因表达。分离盲肠，收集盲肠食糜测定肠道菌群。每栏中的3个样品混合成一个样品作为一个重复。
1.4 测定指标与方法1.4.1 肠道形态结构分析取10 %的福尔马林溶液中固定好的回肠样品包埋于石蜡块中，然后将石蜡块中组织切成8 μm厚附着于载玻片上，用伊红苏木素染色观察肠道形态结构。
1.4.2 肠道氧化应激状态指标测定制 备 回 肠 的 组 织 匀 浆， 测 定 总 超 氧 化 物 歧 化 酶（T-SOD）、总抗氧化酶（T-AOC）和谷胱甘肽还原酶（GR）的酶活以及丙二醛（MDA）与谷胱甘肽（GSH）含量。测定采用南京建成生物功能研究所提供的试剂盒，按照说明书上的操作步骤进行测定。
1.4.3 荧光定量分析从回肠样品中提取RNA，通过应用反转录试剂盒（Takara，北京，中国）进行转录获得cDNA，采用实时荧光定量PCR分析相关基因表达量（引物的序列见表2）。
1.4.4 肠道微生物组成分析盲肠内容物用QIAamp DNA stool Mini天根生化科技（北京）有限公司提取DNA样本。应用16S rDNA扩增子测序技术进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化获得400~450 bp长度的产物 ；委托北京百迈客生物科技有限公司进行文库制备、库检、上机测序以及结果分析等。
1.5 数据统计与分析采 用SPSS 22.0进 行 单 因 素 方 差 分 析（One way ANOVA），用Duncan氏法进行多重比较，以P
2 结果与分析2.1 丁酸钠、益生菌和酶制剂对白羽肉鸡生长性能和死亡率的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，丁酸钠组和复合组肉鸡21 d末 重 显 著 提 高（P
与对照组相比，1~42日龄期间丁酸钠组和复合组肉鸡的平均日增重和日采食量均显著提高（P
2.2 丁酸钠、益生菌和酶制剂对白羽肉鸡肠道形态结构的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，丁酸钠和复合组绒毛高度显著增加（P0.05）；与对照组相比，复合组绒毛高度与隐窝深度的比值显著升高（P0.05）。
2.3 丁酸钠、益生菌和酶制剂对白羽肉鸡肠道氧化应激状态的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，复合组肉鸡肠道T-AOC和GR活 性， 以 及GSH浓 度 显 著 升 高（P0.05）；与对照组相比，丁酸钠组和复合组肉鸡肠道T-SOD活性显著升高（P
2.4 丁酸钠、益生菌和酶制剂对白羽肉鸡肠道炎性因子和紧密连接蛋白基因表达的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，丁酸钠组和复合组肉鸡回肠occludin, claudin-1和ZO-1 mRNA表达量显著增加（P
2.5 丁酸钠、益生菌和酶制剂对白羽肉鸡肠道微生物组成的影响（见表7）由表7可知，微生物组成分析发现丁酸钠组和复合组肉鸡微生物丰富度显著高于对照组（P
3 讨论研究表明，丁酸或者其钠盐丁酸钠可以显著提高肉鸡生长性能[14-15]。也有研究认为，丁酸钠对正常饲养管理下的肉鸡生长性能无显著影响[4,16-17]。本试验结果发现，仅在1~14日龄白羽肉鸡饲料中添加0.1%的丁酸钠即可显著提高肉鸡的生长性能。Leeson等[16]和Smulikowaka等[18]认为，丁酸钠的添加量以及肉鸡所处环境可能是导致上述研究不一致结果的主要原因。因为他们发现，当肉鸡处于高度洁净、病原菌少的环境中时，饲料中添加丁酸钠对肉鸡生长性能无显著影响。此外，本研究发现，在前期（1~21 d）饲粮中同时添加益生菌和酶制剂时，肉鸡生长性能不再显著提高。在后期（22~42 d）饲粮中继续添加益生菌和酶制剂后，肉鸡生长性能虽然与单独添加丁酸钠组无显著差异，但有提高的趋势（0.05
由于本试验过程中肉鸡日粮中未添加任何抗生素或其他促生长以及抗菌类添加剂，因此对照组和试验组肉鸡生长性能远低于实践生产中的生长性能。此外，本试验肉鸡并未处于高度洁净的生长环境，添加丁酸钠显著提高了肉鸡生长性能。
肠上皮的长绒毛和浅隐窝说明肠上皮细胞与营养物质的接触表面积大，这种情况有利于提高肠上皮细胞吸收能力及促进肠道健康发育[19-21]。本试验研究发现，饲粮中添加丁酸钠虽然对白羽肉鸡回肠隐窝深度无显著影响，但可以显著提高回肠绒毛高度。这一结果与之前关于丁酸钠的研究相一致[17]。丁酸钠的这一作用可能是由于其活性成分丁酸可以快速被肠上皮细胞吸收，从而作为能量物质促进肠道细胞发育和提高肠上皮吸收功能等[22]。通过对肠上皮细胞形态学观察发现，饲粮中添加丁酸钠可以减少肠绒毛脱落，维持肠绒毛的完整性。此外，本试验通过检测基因表达还发现丁酸钠同时还促进了肠道紧密连接蛋白的表达。添加丁酸钠的同时添加益生菌和酶制剂同样可以显著提高绒毛高度和肠上皮紧密连接蛋白的表达，但是与单独添加丁酸钠的白羽肉鸡无显著差异（0.05
氧化应激情况下机体促氧化系统和抗氧化系统失衡，从而可能导致营养物质的浪费，且在氧化应激过程中产生的过量自由基可能对机体造成损失[23]。炎症反应通常也伴随着氧化应激发生。本试验结果发现，添加丁酸钠可以显著降低肠道MDA含量，提高SOD活性以及降低IL-1β表达。这些结果进一步证明了丁酸钠的抗炎抗氧化作用[7,17]。而本试验结果还表明，联合添加益生菌和酶制剂可以发挥比单独添加丁酸钠更显著的作用。这说明联合添加丁酸钠、益生菌和酶制剂在缓解应激和炎症反应方面具有协同作用。
大量研究表明，肠道微生物是机体维持生理机能和健康的重要决定因素，且肠道微生物尤其对肠道生理功能发挥重要调节作用[24-25]。研究表明，丁酸钠、益生菌和酶制剂主要通过调节肠道微生物来发挥其作用[10,17, 26]。
本试验结果表明，早期添加丁酸钠可以显著提高盲肠微生物的丰富度，这与Wu等[17]研究结果一致。但也有研究报道丁酸钠对肠道微生物的alpha多样性无显著影响[5,27]。
这种不一致的结果可能是肉鸡所处生长环境，以及丁酸钠的形式，添加浓度和时间等不同而造成的。然而，大部分研究结果都证明丁酸钠影响肠道微生物的beta指数[5,17,27]。
本试验结果也提示添加丁酸钠组微生物组成分布与未添加组是分开的。此外，联合添加益生菌和酶制剂组微生物组成分布与对照组以及单独添加丁酸钠组也是分开的。
各试验组微生物门水平组成无显著变化，本试验的这一结果与之前一些研究不一致[17]。这可能是因为本试验添加丁酸钠时间比较短。此外，联合添加益生菌和酶制剂对微生物门水平组成也无显著影响，说明益生菌和酶制剂可能不在丁酸钠的作用基础上进一步影响微生物。
4 结论在本试验条件下，饲粮中添加丁酸钠或者联合添加丁酸钠、益生菌和酶制剂可以显著提高白羽肉鸡生长性能，降低死亡率，维持肠道形态结构和完整性，缓解炎症和氧化应激以及影响肠道微生物组成。联合添加丁酸钠、益生菌和酶制剂对提高肉鸡生长性能和抗炎抗氧化功能具有一定的协同作用。
